外周血PBMNC分離及凍存

PBMNC分離效果

按照GMP生產規范和臨床ACI要求分離外周血PBMNC，冷凍保存前細胞活性為99.6%±0.4%（n=5），與原始血樣比，PBMNC回收率58.4%±6.52%（n=5）。

細菌和真菌培養陰性，實現全程無菌處理。

不同冷凍保護液對PBMNC的保護效果不同

PBMNC在－196℃液氮中儲存24個月后復蘇，鏡下觀察見細胞形態完整，圓形飽滿，PBMNC復蘇效率89.7%±3.82%，凍存液中含80%無血清培養基組和含80%自體血漿組比較，無統計學差異（P≥0.05）（表1）。

PBMNC凍存后誘導

AIL細胞的體外增殖及表型分析在倒置顯微鏡下觀察顯示，外周血單個核細胞呈懸浮生長，大小均勻，折光性一致，AIL經4d培養后部分細胞明顯增大，可見細胞集落，胞核密度加強，體積增大，胞膜光滑，未見突起，新鮮與凍存后的單個核細胞誘導的AIL在形態和表型上無明顯差別，增殖高峰期均在10－12d。

在培養過程中第14天，凍存組AIL細胞所占相對百分率由約2.3%上升約為10.4%，細胞數增加約1048倍，對照組AIL所占相對百分率由約2.3%上升為約11.3%，細胞數增加約1105倍。兩組之間在細胞增長倍數與AIL所占百分比無顯著差異（P＞0.05）。

（表1）

效應細胞的體外細胞毒活性

新鮮的與凍存的單個核細胞誘導的AIL對NK敏感（K562）或非敏感株細胞（HeLa）及貼壁或懸浮生長的腫瘤細胞均顯示出很強的殺傷活性，且該活性隨效靶濃度比的增加而增大，兩組間的細胞毒活性無顯著性差異（P＞0.05）（表2）。

圖2：比較各種冷凍和對照組之間的增殖和細胞表型。A：所有表型培養前。B：所有在冷凍組表型培養14 天后。C：所有對照組表型培養14 天后，D：所有增殖。E：自體免疫淋巴細胞。