樣本保存方法及冷凍脅迫對蝗蟲基因組DNA提取的影響

以亞洲小車蝗為研究材料，提出了使用液氮保存蝗蟲樣本的有效方法，并用基因組DNA提取試劑盒分別對液氮速凍后保存、直接冷凍、無水乙醇保存和干制蝗蟲標本進行了基因組DNA的提取和電泳檢測。

1材料與方法

1.1供試昆蟲

本試驗研究的昆蟲樣本為亞洲小車蝗成蟲，均采自內蒙古錫林郭勒盟多倫縣農牧交錯區草原，用養蟲籠活體帶回實驗室進行處理保存。

1.2液氮速凍處理

取10頭活的亞洲小車蝗單頭裝入離心管中，將離心管放入液氮中速凍處理3min，取出后在室溫條件下放置12h觀察亞洲小車蝗存活情況。

1.3樣本保存方法

1.3.1液氮速凍后保存

將采集帶回實驗室的活體蝗蟲樣本單頭裝入離心管中，將離心管放入液氮中速凍處理3min，取出后放入-40℃冰箱中保存備用。

1.3.2直接冷凍保存

將采集帶回實驗室的活體蝗蟲樣本單頭裝入離心管中，直接放入-40℃冰箱中保存備用。

1.3.3乙醇保存

將采集帶回實驗室的活體蝗蟲樣本放入無水乙醇(分析純)中保存備用。

1.3.4干制標本

將采集帶回來的活體亞洲小車蝗樣本放入毒瓶中毒死后，針插保存于標本室中，待風干后進行DNA提取試驗。

1.4DNA的提取

將上述4種方法保存的蝗蟲樣本在3個月后進行DNA提取試驗。分別選用單頭亞洲小車蝗的后足股節，無水乙醇(分析純)保存的蝗蟲后足股節需在提取之前先用無菌去離子水沖洗2～3次，將蝗蟲股節放入研缽中用液氮研磨成粉并移入1.5mL離心管中，然后使用天根dp304動物基因組DNA提取試劑盒參照說明書步驟進行基因組DNA提取。

1.5DNA電泳檢測

用1%的瓊脂糖凝膠電泳對提取的蝗蟲基因組DNA進行檢測。取DNA樣品3μL、上樣緩沖液2μL混勻后加入凝膠時預留的點樣孔中，加入DL2000Marker(TaKaRa;第3條帶為150ng/μL)，經過100V恒壓電泳20min，使用紫外凝膠成像系統觀察基因組DNA提取情況并拍照保存。

2結果與分析

2.1液氮速凍處理對樣本保存的影響

液氮速凍處理的10頭亞洲小車蝗樣本在12h內均無存活跡象。說明通過液氮速凍處理能夠使亞洲小車蝗活體樣本迅速死亡，從而消除因逆境脅迫造成的樣本本身生理生化變化，避免了這些變化對蝗蟲樣本基因組DNA提取產生可能的不利影響。

2.2不同保存方法對基因組DNA提取影響

亞洲小車蝗經基因組DNA提取后，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測結果見圖1～3。液氮速凍后保存和無水乙醇保存的樣本提取的基因組DNA電泳條帶清晰，說明得到的DNA濃度較大;直接冷凍保存的樣本提取的DNA電泳檢測結果顯示條帶整齊，但亮度較低，說明得到的DNA濃度較小;蝗蟲干標本提取的基因組DNA電泳檢測顯示條帶不清楚，并有明顯拖尾現象，有的甚至看不到條帶，說明干制標本保存會導致蝗蟲基因組DNA發生嚴重降解，會對下一步基因擴增、分子標記等分子生物學試驗的進行造成不利的影響。

2.3冷凍脅迫對基因組DNA提取影響

對比液氮速凍后保存和直接冷凍保存兩種樣本保存方法對蝗蟲基因組DNA提取結果可以看出，液氮速凍后保存的樣本提取的基因組DNA明顯比直接冷凍保存的樣本基因組DNA的電泳條帶亮度高，說明液氮速凍后保存得到的DNA的濃度較大。由此得出，樣本在受到冷凍脅迫死亡的過程中會發生基因組DNA降解現象，使提取得到的DNA的濃度較小。所以，液氮速凍后保存更適合昆蟲基因組學的研究。

實驗結果：在保存3個月后，檢測蝗蟲樣本直接冷凍法和干標本提取的總DNA濃度較低，因而瓊脂糖電泳檢測亮度低;液氮速凍后保存和無水乙醇保存的蝗蟲樣本提取的基因組DNA濃度大。表明液氮速凍后保存和無水乙醇保存的標本適合用于基因組學研究。通過對比，直接冷凍保存與液氮速凍保存結果得出，蝗蟲在冷凍脅迫死亡的過程中有DNA降解發生。